Totul despre enzimele de restricție

Endonucleazele de restricție sunt o clasă de enzimă care a tăiat moleculele de ADN. Fiecare enzimă recunoaște secvențe unice de nucleotide într-o catena ADN - de obicei aproximativ patru până la șase perechi de baze. Secvențele sunt palindromice prin faptul că șuvița ADN complementară are aceeași secvență în sens invers. Cu alte cuvinte, ambele fire de ADN sunt tăiate în aceeași locație.

Enzimele de restricție se găsesc în multe tulpini diferite de bacterii, unde rolul lor biologic este de a participa la apărarea celulelor. Aceste enzime restricționează ADN străin (viral) care intră în celule distrugându-le. Celulele gazdă au un sistem de modificare a restricțiilor care metilează propriul ADN la site-uri specifice pentru enzimele de restricție respective, protejându-le astfel de clivaj. Peste 800 enzime cunoscute au fost descoperite care recunosc mai mult de 100 de secvențe de nucleotide diferite.

Există cinci tipuri diferite de enzime de restricție. Tipul I taie ADN-ul în locații aleatorii până la 1.000 sau mai multe perechi de baze de pe site-ul de recunoaștere. Tipul III taie la aproximativ 25 de perechi de bază de pe site. Ambele tipuri necesită ATP și pot fi enzime mari cu mai multe subunități. Enzimele de tip II, utilizate în principal în biotehnologie, au tăiat ADN-ul în secvența recunoscută fără a fi nevoie de ATP și sunt mai mici și mai simple.

Enzimele de restricție de tip II sunt denumite în funcție de speciile bacteriene din care sunt izolate. De exemplu, enzima EcoRI a fost izolată de E. coli. Cea mai mare parte a publicului este familiarizată cu E. focare de coli în alimente.

Enzimele de restricție de tip II pot genera două tipuri diferite de tăieri, în funcție de dacă le-au tăiat pe ambele catenele din centrul secvenței de recunoaștere sau fiecare catenă mai aproape de un capăt al recunoașterii secvenţă.

Tăierea anterioară va genera „capete sfâșietoare”, fără a exista modificări nucleotide. Acesta din urmă generează capete „lipicioase” sau „coezive”, deoarece fiecare fragment de ADN rezultat are o suprapunere care completează celelalte fragmente. Ambele sunt utile în genetica moleculară pentru realizare ADN recombinant și proteine. Această formă de ADN se evidențiază pentru că este produsă prin ligarea (legătura împreună) a două sau mai multe catene diferite care nu au fost inițial legate între ele.

Enzimele de tip IV recunosc ADN-ul metilat, iar enzimele de tip V folosesc ARN-uri pentru a tăia secvențe pe organisme invadatoare care nu sunt palindromice.

Enzimele de restricție sunt utilizate în biotehnologie pentru a tăia ADN-ul în catene mai mici, pentru a studia diferențele de lungime a fragmentului între indivizi. Aceasta este denumită polimorfismul lungimii fragmentului de restricție (RFLP). De asemenea, sunt utilizate pentru clonarea genelor.

Tehnici RFLP au fost utilizate pentru a determina că indivizii sau grupurile de indivizi au diferențe distinctive în secvențele de gene și tiparele de clivaj de restricție în anumite zone ale genomului. Cunoașterea acestor domenii unice este baza pentru Amprenta ADN. Fiecare dintre aceste metode depinde de utilizarea electroforeză cu gel de agaroză pentru separarea fragmentelor de ADN. Tamponul TBE, care este format din baza Tris, acid boric și EDTA, este utilizat în mod obișnuit pentru gel de agaroză electroforeză pentru a examina produsele ADN.

Clonarea necesită adesea introducerea unei gene într-o plasmidă, care este un tip de bucată de ADN. Enzimele de restrângere pot ajuta procesul, datorită creșterilor monocatenare pe care le lasă atunci când fac tăieri. ADN-ligază, o enzimă separată, poate uni două molecule de ADN cu capetele potrivite.

Deci, folosind enzime de restricție cu enzime ligază ADN, bucăți de ADN din surse diferite pot fi utilizate pentru a crea o singură moleculă de ADN.