Cum funcționează reacția în lanț a polimerazei pentru a amplifica genele

Reacția în lanț a polimerazei (PCR) este o tehnică genetică moleculară pentru realizarea de copii multiple ale unei gene și este, de asemenea, parte a procesului de secvențiere a genelor.

Copiile genelor sunt făcute folosind o probă de ADN, iar tehnologia este suficient de bună pentru a face mai multe copii dintr-o singură copie a genei găsite în probă. Amplificarea prin PCR a unei gene pentru a face milioane de copii, permite detectarea și identificarea secvențelor de gene folosind tehnici vizuale bazate pe dimensiunea și încărcarea (+ sau -) a bucății de ADN.

În condiții controlate, segmente mici de ADN sunt generate de enzime cunoscute sub numele de ADN polimeraze, care adaugă deoxinucleotide complementare. (dNTPs) la o bucată de ADN cunoscută sub numele de „șablon”. Chiar și bucăți mai mici de ADN, numite „amorsări” sunt folosite ca punct de plecare pentru polimeraza.

Primerii sunt bucăți mici de ADN (oligomeri), fabricate de om, de obicei cu lungimea cuprinsă între 15 și 30 de nucleotide. Ele sunt realizate prin cunoașterea sau ghicirea unor secvențe scurte de ADN la extremitățile genei care este amplificată. În timpul PCR, ADN-ul care este secvențial este încălzit și catenele duble se separă. La răcire, primerii se leagă de șablon (numit recoacere) și creează un loc pentru ca polimeraza să înceapă.

Reacția în lanț a polimerazei (PCR) a fost posibilă prin descoperirea termofilelor și termofilelor enzime polimerază (enzime care mențin integritatea structurală și funcționalitatea după încălzire la temperaturi ridicate temperaturile). Pașii implicați în tehnica PCR sunt următorii:

• Se creează un amestec, cu concentrații optimizate ale șablonului ADN, enzimei polimerază, primeri și dNTP. Capacitatea de a încălzi amestecul fără denaturarea enzimei permite denaturarea dublei helix a probei de ADN la temperaturi în intervalul de 94 de grade Celsius.
• După denaturare, proba este răcită la un interval mai moderat, în jur de 54 de grade, ceea ce facilitează recoacere (legarea) primerilor de șabloanele ADN monocatenar.
• În a treia etapă a ciclului, proba este reîncălzită la 72 de grade, temperatura ideală pentru Taq DNA Polymerase, pentru alungire. În timpul alungirii, ADN-polimeraza folosește un singur catenar original de ADN ca șablon pentru a adăuga dNTP-uri complementare la capetele 3’ ale fiecărui primer și generează o secțiune de ADN dublu catenar în regiunea genei de interes.
• Primerii care s-au adaptat la secvențele de ADN care nu sunt o potrivire exactă nu rămân recoapți la 72 de grade, limitând astfel alungirea la gena de interes.

Acest proces de denaturare, recoacere și alungire se repetă de mai multe ori (30-40), crescând astfel exponențial numărul de copii ale genei dorite în amestec. Deși acest proces ar fi destul de obositor dacă ar fi efectuat manual, probele pot fi pregătite și incubate într-un Thermocycler programabil, acum obișnuit în majoritatea laboratoarelor moleculare, și o reacție PCR completă poate fi efectuată în 3-4 ore.

Fiecare etapă de denaturare oprește procesul de alungire a ciclului anterior, trunchiind astfel noua catenă de ADN și menținând-o la aproximativ dimensiunea genei dorite. Durata ciclului de alungire poate fi făcută mai lungă sau mai scurtă în funcție de mărimea genei de interes, dar în cele din urmă, prin cicluri repetate de PCR, majoritatea șabloanelor vor fi limitate doar la dimensiunea genei de interes, deoarece acestea vor fi generate din produsele ambelor grunduri.

Există mai multe diferite factori pentru PCR de succes care poate fi manipulat pentru a îmbunătăți rezultatele. Cea mai utilizată metodă de testare a prezenței produsului PCR este electroforeza pe gel de agaroză. Care este folosit pentru a separa fragmentele de ADN în funcție de dimensiune și încărcare. Fragmentele sunt apoi vizualizate folosind coloranți sau radioizotopi.

De la descoperirea PCR, au fost descoperite ADN polimeraze, altele decât Taq original. Unele dintre acestea au o capacitate de „corectură” mai bună sau sunt mai stabile la temperaturi mai ridicate, îmbunătățind astfel specificitatea PCR și reducând erorile de la inserarea dNTP incorect.

Unele variații ale PCR au fost concepute pentru aplicații specifice și sunt acum utilizate în mod regulat în laboratoarele de genetică moleculară. Unele dintre acestea sunt PCR în timp real și PCR cu transcriptază inversă. Descoperirea PCR a condus, de asemenea, la dezvoltarea secvențierii ADN-ului, Amprenta ADN și alte tehnici moleculare.