Campul de biotehnologie este una de schimbare constantă. Creșterea și dezvoltarea rapidă a cercetării de ultimă oră depind de inovația și creativitatea oamenii de știință și capacitatea lor de a vedea potențialul într-o tehnică moleculară de bază și de a-l aplica pe noi procese. Apariția reacției în lanț a polimerazei (PCR) a deschis multe uși în cercetarea genetică, inclusiv un mijloc de Analiză ADN și identificarea diferitelor gene bazate pe secvențele ADN ale acestora. Secvențializarea ADN-ului depinde și de capacitatea noastră de a folosi electroforeză cu gel pentru a separa catene de ADN care diferă ca mărime cu o pereche de baze.
Secvențiere ADN
La sfârșitul anilor 70, s-au inventat două tehnici de secvențiere a ADN-ului pentru molecule de ADN mai lungi: metoda Sanger (sau dideoxi) și metoda Maxam-Gilbert (clivaj chimic). Metoda Maxam-Gilbert se bazează pe scindarea specifică nucleotidelor de către substanțe chimice și este cel mai bine utilizată pentru a secunda oligonucleotide (polimeri nucleotide scurte, de obicei mai mici de 50 de perechi de bază în lungime). Metoda Sanger este mai frecvent utilizată deoarece s-a dovedit mai ușor de aplicat din punct de vedere tehnic și, odată cu apariția PCR și automatizarea tehnicii, este ușor de aplicat pe catene lungi de ADN, inclusiv unele întregi gene. Această tehnică se bazează pe încetarea lanțului de către dideoxinucleotide în timpul reacțiilor de alungire a PCR.
Metoda Sanger
În metoda Sanger, catena ADN care trebuie analizată este utilizată ca șablon și ADN polimeraza este utilizată, într-o reacție PCR, pentru a genera catenele complementare folosind primeri. Patru amestecuri de reacție PCR diferite sunt preparate, fiecare conținând un anumit procent de analogi de dideoxinucleozide trifosfat (ddNTP) la unul dintre cele patru nucleotide (ATP, CTP, GTP sau TTP).
Sinteza noii catene ADN continuă până când unul dintre acești analogi este încorporat, moment în care catenul este trunchiat prematur. Fiecare reacție PCR va ajunge să conțină un amestec de lungimi diferite de catene de ADN, toate sfârșind cu nucleotida care a fost marcată cu dideoxi pentru acea reacție. Gel electroforeză este apoi utilizată pentru a separa șuvițele celor patru reacții, în patru benzi separate și pentru a determina secvența șablonului inițial pe baza ce lungimi ale catenelor se termină cu ce nucleotidă.
În reacția automată Sanger, se utilizează primerii care sunt etichetați cu patru etichete fluorescente diferite de culoare. Reacțiile PCR, în prezența diferitelor dideoxinucleotide, sunt efectuate așa cum este descris mai sus. Totuși, apoi, cele patru amestecuri de reacție sunt apoi combinate și aplicate pe o singură bandă a unui gel. Culoarea fiecărui fragment este detectată folosind un fascicul laser și informațiile sunt colectate de un computer care generează cromatograme care prezintă vârfuri pentru fiecare culoare, din care poate fi secvența ADN șablon determinat.
De obicei, metoda de secvențiere automată este exactă numai pentru secvențe de până la maximum 700-800 de perechi de baze în lungime. Cu toate acestea, este posibil să se obțină secvențe complete de gene mai mari și, de fapt, genomuri întregi, folosind metode înțelepte, cum ar fi secvențierea Primer Walking și Shotgun.
În Primer Walking, o porțiune viabilă a unei gene mai mari este secvențiată folosind metoda Sanger. Primeri noi sunt generați dintr-un segment de încredere al secvenței și folosiți pentru a continua secvențializarea porțiunii genei care nu se află în limitele reacțiilor inițiale.
Secvențializarea pistolelor implică tăierea aleatorie a segmentului ADN de interes în mai adecvat fragmente de dimensiuni (gestionabile), secvențând fiecare fragment și aranjând piesele pe baza suprapunerii secvențe. Această tehnică a fost simplificată prin aplicarea de software pentru aranjarea pieselor care se suprapun.